In vivo a kimotripszin egy proteolitikus enzim (szerin proteáz), amely számos szervezet emésztőrendszerében működik. Elősegíti a peptidkötések hasítását egy hidrolízisreakcióval, amely annak ellenére, hogy termodinamikailag kedvező, katalizátor hiányában rendkívül lassan megy végbe. A kimotripszin fő szubsztrátjai olyan peptidkötések, amelyekben a kötés N-terminális aminosava triptofán, tirozin, fenilalanin vagy leucin. Számos proteázhoz hasonlóan a kimotripszin is hidrolizálja az amidkötéseket in vitro, ami lehetővé tette az olyan szubsztrátanalógok, mint az N-acetil-L-fenilalanin p-nitrofenil-amid használatát az enzimvizsgálatokhoz.
A chymotripszin a peptidkötéseket úgy hasítja, hogy egy erős nukleofillal támadja meg az unreaktív karbonilcsoportot, az enzim aktív helyén található szerin 195 maradékot, amely rövid időre kovalensen kötődik a szubsztráthoz, enzim-szubsztrát intermediert képezve. Az 57-es hisztidin és a 102-es aszparaginsav mellett ez a szerin-maradék alkotja az aktív centrum katalitikus triádját.
Ezek az eredmények gátlási vizsgálatokon és a fent említett szubsztrát hasadásának kinetikájának vizsgálatán alapulnak, kihasználva azt a tényt, hogy az enzim-szubsztrát intermedier p-nitrofenolát sárga színű, ami lehetővé teszi koncentrációjának mérését a 410 nm-en mért fényabszorbancia mérésével.
A kimotripszinnek a szubsztrátjával való reakciója két szakaszban zajlik, egy kezdeti “robbanási” fázisban a reakció kezdetén és egy Michaelis-Menten-kinetikát követő állandósult fázisban. A kimotripszin hatásmechanizmusa ezt azzal magyarázza, hogy a hidrolízis két lépésben zajlik. Először a szubsztrát acilálása egy acil-enzim intermedier képződéséhez, majd deacilálása az enzim eredeti állapotba való visszatéréséhez. Ez a katalitikus triád három aminosav-maradékának összehangolt működése révén történik. Az aszpartát hidrogénkötést létesít a hisztidin N-δ hidrogénjéhez, megnövelve annak ε nitrogénjének pKa értékét, így képessé válik a szerin deprotonálására. Ez a deprotonálás lehetővé teszi, hogy a szerin oldallánc nukleofilként viselkedjen, és a fehérje fő láncának elektronhiányos karbonil szénatomjához kötődjön. A karbonil oxigén ionizációját a szomszédos főlánc N-hidrogénjeihez kialakuló két hidrogénkötés stabilizálja. Ez az oxianionlyukban történik. Ez egy tetraéderes adduktot és a peptidkötés megszakadását eredményezi. A szerinhez kötött acil-enzim intermedier keletkezik, és a hasított fehérje újonnan képződött aminoterminusza disszociálódhat. A második reakciólépésben egy vízmolekulát aktivál a bázikus hisztidin, és nukleofilként viselkedik. A víz oxigénje megtámadja a szerinhez kötött acilcsoport karbonil-szénjét, ami egy második tetraéderes addukt kialakulásához, a szerin -OH csoport regenerálódásához és egy proton felszabadulásához, valamint az újonnan kialakult karboxil terminussal rendelkező fehérje fragmentumhoz vezet