In vivo, la quimotripsina es una enzima proteolítica (serina proteasa) que actúa en el sistema digestivo de muchos organismos. Facilita la ruptura de los enlaces peptídicos mediante una reacción de hidrólisis que, a pesar de ser termodinámicamente favorable, se produce con extrema lentitud en ausencia de un catalizador. Los principales sustratos de la quimotripsina son los enlaces peptídicos en los que el aminoácido N-terminal del enlace es un triptófano, tirosina, fenilalanina o leucina. Al igual que muchas proteasas, la quimotripsina también hidroliza enlaces amídicos in vitro, una virtud que permitió el uso de análogos de sustrato como la N-acetil-L-fenilalanina p-nitrofenil amida para los ensayos enzimáticos.
La quimotripsina escinde los enlaces peptídicos atacando el grupo carbonilo no reactivo con un potente nucleófilo, el residuo de serina 195 situado en el sitio activo de la enzima, que se une brevemente de forma covalente al sustrato, formando un intermediario enzima-sustrato. Junto con la histidina 57 y el ácido aspártico 102, este residuo de serina constituye la tríada catalítica del sitio activo.
Estos hallazgos se basan en ensayos de inhibición y en el estudio de la cinética de escisión del sustrato mencionado, explotando el hecho de que el intermedio enzima-sustrato p-nitrofenolato tiene un color amarillo, lo que permite medir su concentración mediante la medición de la absorbancia de la luz a 410 nm.
Se comprobó que la reacción de la quimotripsina con su sustrato tiene lugar en dos etapas, una fase inicial de «ráfaga» al comienzo de la reacción y una fase de estado estacionario que sigue la cinética de Michaelis-Menten. El modo de acción de la quimotripsina lo explica porque la hidrólisis tiene lugar en dos etapas. En primer lugar, la acilación del sustrato para formar un intermedio acil-enzima y, a continuación, la desacilación para devolver la enzima a su estado original. Esto ocurre a través de la acción concertada de los residuos de tres aminoácidos en la tríada catalítica. El aspartato se une al hidrógeno N-δ de la histidina, aumentando el pKa de su nitrógeno ε, lo que le permite desprotonar la serina. Esta desprotonación permite que la cadena lateral de la serina actúe como un nucleófilo y se una al carbono carbonilo deficiente en electrones de la cadena principal de la proteína. La ionización del oxígeno carbonilo se estabiliza mediante la formación de dos enlaces de hidrógeno con los N-hidrógenos adyacentes de la cadena principal. Esto ocurre en el hueco del oxianión. Esto forma un aducto tetraédrico y la ruptura del enlace peptídico. Se forma un intermedio acil-enzima, unido a la serina, y el nuevo extremo amino de la proteína escindida puede disociarse. En el segundo paso de la reacción, una molécula de agua es activada por la histidina básica y actúa como nucleófilo. El oxígeno del agua ataca el carbono carbonilo del grupo acilo unido a la serina, lo que resulta en la formación de un segundo aducto tetraédrico, la regeneración del grupo -OH de la serina, y la liberación de un protón, así como el fragmento de proteína con el extremo carboxilo recién formado